小西秀明(博士後期課程学生)、浅井賢(元博士後期課程学生)、渡邉朋信博士(RIKEN、QBiC、グループリーダー)、吉村成弘准教授(分子情報解析学分野)の研究成果が、英国学術誌「Scientific Reports」に掲載されました。

吉村成弘 生命科学研究科准教授、小西秀明 同博士後期課程学生、浅井賢 同元博士後期課程学生らの研究グループは、理化学研究所 生命システム研究センター(RIKEN, QBiC) 渡邉朋信博士 グループリーダーと共同で、細胞内部のタンパク質クラウディングに感受性を示す「GimRET」と呼ばれる蛍光タンパク質プローブを用いて、生細胞内におけるタンパク質クラウディング(分子混雑)の局所的な偏りをイメージングすることに成功しました。これにより、核膜孔内部における構造と機能とを結びつける新しいモデルを提唱しました。

本研究成果は、英国学術誌「Scientific Reports」誌でオンライン公開(2017年7月18日付)されました。

– 研究者からのコメント

我々の細胞内は、膨大な量の生体高分子が非常に混み合っており(推定、300 mg/mL以上)、その分子混雑(クラウディング)の中で、各分子は適時適切に機能しています。しかし、これまでの生化学的、いわゆる試験管内での希釈溶液中(数10 mg/mL)での実験系では、その細胞内のクラウディングを考慮した、本来の細胞内での機能を明らかにすることが困難です。今回我々は、「GimRET」を利用して、真核細胞の細胞質-核質間の物質輸送を制御するゲートキーパーである、核膜孔複合体(以下、核膜孔)内部の局所的なクラウディング環境を直接可視化・定量しました。この成果は、試験管内での実験系では情報を得ることが出来ない、実際の細胞内におけるクラウディングを直接定量することが可能であり、今後、他の標的タンパク質との融合タンパク質を用いた、様々な細胞内器官への応用が期待できます。

概要-

核膜孔内部は、天然変性タンパク質と呼ばれる、非構造タンパク質群が密集し、そのクラウディングにより非常に疎水的な環境を形成、そしてバリア(核膜孔バリア)として機能することで、通過分子の選択を行っていることが示唆されていました。しかし、これまでの研究では、その特殊な環境から、バリアの構造・性質を解明するための研究方法は、1分子解析などによる間接的な手法に限られており、実際の細胞内ではどこにそのバリアが局在しているのか、どのように形成されているのか、という情報はこれまで明らかにすることが困難でした。

 そこで、細胞内タンパク質クラウディング感受性蛍光タンパク質プローブ「GimRET」と10種類以上の核膜孔構成タンパク質(ヌクレオポリン:Nup)との融合タンパク質を作製し、それらを生細胞内で発現させ、局在部位でのクラウディングを計測しました。詳細な定量解析から、1) 核膜孔内部は、全体的に細胞質よりも強いクラウディングを示す、2) 核膜孔中心部よりも細胞質側および核質側の物質の出入り口となる、核膜近傍付近が最も強いクラウディングを示す、という事を明らかにしました。この結果から、間期核膜孔は、物質輸送に対する主要なバリアを中心部に形成しているのではなく、物質の「入り口」および「出口」となる核膜近傍にバリアを形成している事を生細胞内で明らかにしました。

 さらに、核膜孔が細胞分裂期後期に、崩壊・再構築されるプロセスに着目し、その過程でどのように核膜孔バリアが再構築されているのかということを調査しました。

間期と同様に、GimRETとNupとの融合タンパク質を発現させたM期生細胞内で経時観察しました。詳細なシグナル解析から、1) 核膜孔再構築初期段階における、Nupのクロマチン上への集合は、非常に強いクラウディングを伴う、2) 間期に観察された、核質側および細胞質側に局在する核膜孔バリアは、再構築段階において独立して形成される、という事を明らかにしました。この結果は、試験管内で行われる、単純なタンパク質間相互作用によるタンパク質複合体形成では明らかにすることが出来ない、クラウディング中における非構造タンパク質どうしの弱い相互作用の集積が、核膜孔のような巨大なタンパク質複合体の形成に重要であることを初めて示しました。

 

DOI: 10.1038/s41598-017-05959-w

In vivo analysis of protein crowding within the nuclear pore complex in interphase and mitosis (2017)

Hide A. Konishi, Suguru Asai, Tomonobu M. Watanabe, and Shige H. Yoshimura, Scientific Reports 7 (5709)