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Raichu

図5.1.2

図5.1.4

図5.1.5

Raichuの構造:

RaichuはRasをセンサー領域にセリンスレオニンキナーゼRafのRas結合ドメイン(RBD)をリガンド領域として使用している(図5.1.2)。Rasが活性化因子によりGTP結合型になると、RafのRBDに対する親和性が向上し、分子内で結合する。これによりFRET効率が上昇するシステムである(図5.1.3)。RasとRafRBDとの結合は、すでに結晶解析がなされている(図5.1.4)。この図で明らかなように、RafRBDのC末とRasのN末が非常に近いところに存在する。当然の如く、当初作成したモデルは、RafをN末にRasをC末に置いていた。テストしたのは図5.1.5に示すようなトポロジーのもので、これらは、RasがGDP型からGTP型に変化してもFRET効率が変化してくれなかった。うまくいったのは、RasとRafの順番を入れ替えた最後にテストしたものである。振り返って、図5.1.4を見てみても、RafRBDのN末とRasのC末はかなり離れており、やはりあまり良いアイデアのようには見えないことがわかるだろう。作成時点(2000年ごろ)の知識では、結晶解析のデータからどういうデザインがFRETを起しやすいかは予想できなかった。最近は、構造モデリングの技術も格段に進歩しているので、今後、その情報をもとにして優れたプローブが作成されることが期待される。

スペーサー:

Rasの場合、YFPのC末は1個削ったのみ、Rap1の場合は11個削ったものがもっとも刺激依存性のFRET効率の変化が大きかった。RasあるいはRap1とRafとの間の長さは、Rap1は30アミノ酸程度まで長くしたものが効率がよかった。Rasに関しては大きな差は認められなかった。RafとCFPとの間のスペーサーは、入れたものも入れなかったものも大差なかった。

リガンド領域:

ところで、有識者の方々はどうしてRap1のリガンドにもRafを用いたか疑問に思われることであろう。Rap1はRafには弱くしか結合せず、むしろRalGDSなどがよい標的と考えられているのである。実は、RalGDSをリガンド領域に使ったものを最初に作成した。これは、FRETが非常に効率よく起きるのであるが、活性化因子であるGEFを一緒に入れてもFRET効率があまり上昇しない。GAPをいれるとFRET効率は下がる。つまり、Raich−Rap1は非刺激時でもGTP結合型が優勢になっている。これは、RasファミリーG蛋白の標的分子は一般にGAPに対する阻害作用があり、RasをGTP結合型に保とうとするからである。すなわちリガンド領域とセンサー領域のアフィニティーが高すぎると、センサーの感度が低下してしまう。

センサー領域:

Rasには非常に多くの変異体が知られている。Rasの12番のGlyをValに変化させると恒常的活性化型のRaichu-Rasができるし、40番目のSerをCysに代えるとRafに結合しないので、活性化できないRaichu-Rasを作成できる。これらは、コントロールとして有用である。さらに未発表のものとして、Rasの温度感受性変異体をいれたものも多数作成している。これらは、上記のようにRafがGAPインヒビターとして働くので、RasとRafとの結合を弱くしてGAPに対する感受性を強くする目的で作成されている。

Raichuの諸性能:

さて、プローブを作成した後、これらが確かに生理的なRasシグナルを反映しているかなどを確認する必要がある。我々が確認したのは以下の項目である。

  1. 活性化因子(GEF)と不活性化因子(GAP)に対する反応性
  2. Raichuに結合しているGTP/GDP比とFRET(YFP/CFP)との相関
  3. Raichuに結合しているGTP/GDP比と内在性のRasのGTP/GDP比
  4. Raichuによる内在性シグナルへの影響

詳細なPlasmid情報はここ

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